Полимеразная цепная реакция днк

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)— экспериментальный метод молекулярной биологии, который представляет собой специфическую амплификацию нуклеиновых кислот, индуцируемую синтетическими олигонуклеотидными праймерами in vitro.

Идея разработки метода ПЦР принадлежит американскому исследователю Kary Mullis, который в 1983 г. создал метод, позволивший амплифицировать ДНК в ходе циклических удвоений с помощью фермента ДНК-полимеразы в искусственных условиях. Через несколько лет после опубликования этой идеи, в 1993 г., К. Mullis получил за нее Нобелевскую премию.

В начале использования метода после каждого цикла нагревания- охлаждения приходилось добавлять в реакционную смесь ДНК-полимеразу, так как она быстро инактивировалась при высокой температуре. Процедура была очень неэффективной, требовала много времени и фермента. В 1986 г. ее существенно модифицировали за счет использования ДНК-полимеразы из термофильных бактерий. Эти ферменты способны выдерживать множество циклов реакции, что позволяет автоматизировать проведение ПЦР. Одна из наиболее часто использовавшихся термостабильных ДНК-полимераз была выделена из бактерий Thermus aquaticus и названа Taq-ДНК-полимеразой.

Суть метода.Метод основан на многократном избирательном копировании определенного участка ДНК при помощи фермента Taq- ДНК-полимеразы. Полимеразная цепная реакция позволяет получить амплификаты длиной до нескольких тысяч пар нуклеотидов. Для увеличения длины ПЦР-продукта до 20-40 тыс. пар нуклеотидов применяют смесь различных полимераз, но все равно это значительно меньше длины хромосомной ДНК эукаротической клетки.

Реакция проводится в программируемом термостате (амплификаторе) — приборе, который может проводить достаточно быстро

охлаждение и нагревание пробирок (обычно с точностью не менее 0,1 °С). Амплификаторы позволяют задавать сложные программы, в том числе с возможностью «горячего старта» и последующего хранения. Для ПЦР в режиме реального времени выпускают приборы, оборудованные флуоресцентным детектором. Существуют также приборы с автоматической крышкой и отделением для микропланшет, что позволяет встраивать их в автоматизированные системы.

Обычно при проведении ПЦР выполняется 20-45 циклов, каждый из которых состоит из трех стадий: денатурации, отжига праймеров, элонгации (рис. 6.1 и 6.2). На рис. 6.1 представлена динамика изменения температуры в пробирке при проведении цикла ПЦР.

Рис. 6.1.График изменения температуры в пробирке в течение одного цикла полимеразной цепной реакции

Денатурация ДНК-матрицыпроводится с помощью нагревания реакционной смеси до 94-96 °С на 5-90 с, чтобы цепи ДНК разошлись. Следует отметить, что перед первым циклом осуществляют предварительный прогрев реакционной смеси в течение 2-5 мин для полной денатурации исходной матрицы, что позволяет снизить количество неспецифичных продуктов реакции.

Рис. 6.2.Схема первого цикла полимеразной цепной реакции

Стадия отжига праймеров.При плавном снижении температуры праймеры комплементарно связываются с матрицей. Температура отжига зависит от состава праймеров и обычно она на 4-5° ниже расчетной температуры плавления. Длительность стадии — 5-60 с.

Во время следующей стадии — элонгации— происходит синтез дочерней цепи ДНК на матрице материнской. Температура элонгации зависит от полимеразы. Часто используемые ДНК-полимеразы Taq и Pfu наиболее активны при 72 °С. Время элонгации, в основном зависящее от длины ПЦР-продукта, обычно составляет 1 мин на каждую тысячу пар оснований.

После проведения ПЦР проба инкубируется при температуре 72 °С в течение 10 мин. Количество специфического продукта реакции (ограниченного праймерами) при 100% эффективности теоретически возрастает в геометрической прогрессии по формуле Р = 2 n , где Р — количество специфического продукта, а η — число циклов реакции. Практически эффективность ПЦР меньше 100%, поэтому в действительности P = (1 + E) n ,где P — количество продукта; Е — средняя эффективность цикла; а n — число циклов реакции.

При большем, чем указано, количестве циклов реакции происходит накопление неспецифических продуктов последней. Рост требуемого продукта в геометрической прогрессии ограничен числом реагентов, присутствием ингибиторов и побочных продуктов реакции. На последних циклах рост замедляется, это называют «эффектом плато» (рис. 6.3). Кинетика ПЦР имеет экспоненциальный характер только на начальном этапе, после чего начинается выход на плато в силу истощений в реакции компонентов (dNTP, праймеров) и нарастающего температурного повреждения Таq-ДНК-полимеразы, конкуренции за фермент амплификонов.

Компоненты полимеразной цепной реакции.Компоненты, используемые в ПЦР, следующие: Taq-ДНК-полимераза, дезоксирибонуклеотидтрифосфаты, буферный раствор, «прямой» и «обратный» праймеры, а также ДНК-матрица.

Фермент Taq-ДНК-полимераза. При оптимальных условиях в реакционной смеси ПЦР (50-100 мкл) фермент содержится в количестве 0,5-2 единиц на пробу. Taq-ДНК-полимераза синтезирует цепь ДНК до 1000 пар оснований в минуту. Увеличивая время полимеризации и подбирая новые разновидности ДНК-полимеразы, обладающие и экзонуклеазной (редактирующей) активностью, вырезающей ошибочные (некомплементарные) нуклеотиды, удалось получить очень

длинные амплифицированные ДНК — до 42 тыс. пар оснований (Лонг-ПЦР). Избыток Таq-ДНК-полимеразы увеличивает образование неспецифических продуктов ПЦР.

Рис. 6.3.Динамика накопления продукта при полимеразной цепной реакции

dNTP. Дезоксирибонуклеотидтрифосфаты (dNTP), используемые в ПЦР, следующие: dATP, dGTP, gTTP, dCTP. dNTP содержатся в реакционной смеси в эквивалентных концентрациях от 200 до 500 мкм, так как избыток какого-либо из них увеличивает ложное спаривание нуклеотидов в ПЦР.

Праймеры. Специфичность ПЦР основана на образовании комплементарных комплексов между матрицей и праймерами, каждый из последних комплементарен одной из цепей двухцепочечной матрицы, обрамляет начало и конец амплифицируемого участка (рис. 6.4).

Поскольку праймеры каждый раз встраиваются в амплифицируемые фрагменты ДНК-матрицы (амплификоны), то они должны в реакционной смеси ПЦР присутствовать в избытке, и концентрация их составляет 0,5-1 мкМ. Специфичность получаемого продукта

ПЦР в значительной степени определяется так называемой температурой отжига праймеров, при которой они взаимодействуют с комплементарными участками ДНК-матрицы, образуя двухцепочечные структуры.

Рис. 6.4.Пример «прямого» и «обратного» праймеров

Буферная система. 10-кратный буфер для ПЦР чаще всего имеет состав: 0,5 М KCl; 0,2 М Трис-HCl, pH 8,4; 25 мМ MgCl₂; 1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (БСА) — пример стандартной прописи буферной системы.

Tris Cl.Высокое значение рН нужно из-за того, что при повышении температуры рН Tris-буфера падает и при 72 °С составляет

KCl.Средние концентрации KCl стимулируют на 40-60% активность Taq-ДНК-полимеразы (но 0,2 M полностью ингибирует полимеразную активность).

MgCl₂.Диапазон рабочих концентраций: 0,5-5 мМ. Увеличение концентрации Mg 2+ оказывает очень резкое влияние на специфичность и эффективность ПЦР: увеличивается выход, но более высокими темпами уменьшается специфичность. Оптимум зависит от последовательностей матрицы и праймеров.

Таким образом, слишком низкая концентрация Mg 2+ — низкий выход, слишком высокая — неспецифическая амплификация.

На молекулярном уровне: Mg 2+ образует комплексы с dNTP’s. Именно эти комплексы являются субстратом для Taq-ДНК- полимеразы. C Mg 2 + стехиометрически связываются dNTP’s, PPi, EDTA, PO₄. Повышение концентрации Mg 2+ вызывает повышение температуры плавления ДНК.

В полимеразной цепной реакции используется вода высокой очистки (MQ). В зависимости от конструкции прибора (если «крышка» амплификатора не нагревается) в реакцию бывает необходимым на ПЦР-смесь наслаивать стерильное минеральное масло для предотвращения испарения пробы.

ДНК-матрица. Общее количество ДНК, вносимой в пробирку для ПЦР, не должно превышать 1 мкг, ибо большой избыток неспецифической ДНК снижает специфичность и чувствительность ПЦРамплификации ДНК-матрицы. Подготовка пробы материала (выделение ДНК или РНК) должна проводиться в условиях, исключающих перекрестное загрязнение исследуемых проб выделяемыми нуклеиновыми кислотами.

Чтобы ПЦР прошла успешно, должна произойти гибридизация праймеров с нужной последовательностью-мишенью. Если эта последовательность слегка различается у разных индивидуумов или у микроорганизмов из разных изолятов (т.е. имеет место полиморфизм), может произойти ее неполное спаривание с амплимером и нарушение нормальной амплификации, что приведет к получению ложноотрицательного результата. Следует отметить: у человека большая часть геномных последовательностей консервативна и не различается у разных индивидуумов, а потому обычно в таких случаях для работы подходят одинаковые наборы «консервативных» праймеров.

Контаминация.Для исключения ложноположительного результата необходимо обязательное использование чистых перчаток, одноразовых пробирок и наконечников к автоматическим пипеткам, проведение предварительной ультрафиолетовой обработки помещения и рабочих поверхностей столов и приборов. Подчеркнем: ДНКматрицы генов клеток, вирусов и бактерий пригодны для ПЦР в течение десятков лет даже после замораживания, высушивания, температурной или химической денатурации белков и др.

Чувствительность ПЦР порой достигает математически возможного предела (детекции 1 копии ДНК-матрицы), поэтому существует высокая степень опасности получения ложноположительного результата в силу переноса через предметы и реагенты как самой ДНКматрицы (реже), так и амплификонов (очень часто), получаемых в больших количествах во многих пробирках в течение ежедневной работы.

Причинами ложноположительных результатов являются следующие 3 вида контаминаций.

1. Контаминация от пробы к пробе (в процессе обработки клинических образцов или при раскапывании реакционной смеси), приводящая к появлению спорадических ложноположительных результатов.

2. Контаминация рекомбинантными плазмидами, содержащими клонированные последовательности детектируемого гена.

3. Контаминация продуктами амплификации (амплификонами). Она — наиболее частая причина ложноположительных результатов, поскольку в процессе ПЦР-генодиагностики амплификоны накапливаются в больших количествах и очень легко переносятся с аэрозолями и через приборы. Поэтому детекция продуктов ПЦР должна проводиться в изолированной комнате сотрудником, не производящим обработку клинических образцов и не готовящим реактивы для ПЦР. Приготовление основных растворов также должно производиться в отдельной чистой комнате. Все растворы следует хранить и использовать небольшими порциями.

Необходимо постоянно осуществлять собственные виды лабораторного контроля и периодически применять зашифрованные отрицательные и положительные контрольные образцы для оценки специфичности и чувствительности ПЦР-генодиагностических исследований. Неуклонно выполняя эти требования и выполняя в каждой ПЦР отрицательный контроль разных типов (на процедуру обратной транскрипции, буферный раствор, праймеры), можно практически исключить ложноположительные результаты ПЦР.

Очень важен для правильной интерпретации результатов выбор способов контроля. Положительный и отрицательный контроль должен быть хорошо охарактеризован. Часто используют ДНК из клеточных линий, заведомо содержащих или не содержащих последовательность-мишень. В каждом анализе нужны как минимум три вида контроля:

1) положительный контроль (образец заведомо содержит последовательность-мишень);

2) отрицательный контроль (образец заведомо не содержит последовательность-мишень);

3) бланк-контроль (реакционная смесь, в которой присутствуют все компоненты за исключением ДНК; бланк-контроль является индикатором загрязнений).

Один тип положительного контроля должен содержать максимальное число последовательностей-мишеней, другой — небольшое их число. Это позволяет определить чувствительность и эффективность ПЦР.

Детекция.Для анализа ПЦР-амплифицированной ДНК существуют разные методы: гель-электрофорез, дот-блот-гибридизацию и блот-гибридизацию по Саузерну. С их помощью можно анализировать большинство ПЦР-продуктов, но абсолютно точные результаты получают только при секвенировании. Следует отметить: в дальнейших главах будет описана модификация ПЦР — полимеразная цепная реакция в режиме реального времени, в которой детекция возрастания количества ПЦР-продуктов осуществляется непосредственно в пробирке при прохождении реакции (см. ниже).

Рис. 6.5.Фотография электрофоретического геля с ПЦР-продуктами

Присутствие специфического ПЦР-продукта (амплификона) в подавляющем большинстве случаев детектируют электрофоретическим разделением ПЦР-амплификационной смеси на окрашенных бромистым этидием агарозном или полиакриламидном гелях. Для такого выявления необходимо не менее 20 нг ДНК. Специфичность полосы амплифицированной ДНК подтверждается ее положением (размерами) по отношению к маркерным фрагментам и ДНКстандарту. Дополнительные доказательства специфичности амплификона получают путем расщепления специфическими рестриктазными

ферментами или путем гибридизации со специфическим радиоактивным или флуоресцентным олигонуклеотидным зондом.

Рис. 6.6.Устройство горизонтальной электрофоретической камеры

Электрофорез в агарозном геле позволяет легко, без применения радиоизотопов, обнаружить амплифицированную ДНК и определить ее размер (рис. 6.5 и 6.6). Остановимся на некоторых ее особенностях применительно к анализу ПЦР-амплифицированной ДНК:

а) 10-20 мкл амплифицированной ДНК разделяют в 2% агарозном геле вместе со стандартными фрагментами размером 50-1000 пар нуклеотидов;

б) электрофорез проводят при высоком напряжении (10-15 В/см), поскольку образующиеся при ПЦР небольшие фрагменты сложно детектировать после электрофореза в течение ночи при небольшом напряжении вследствие их интенсивной диффузии.

Разрешение можно повысить, используя полиакриламидные или агарозные гели с высокой концентрацией агарозы (3-4%). Впрочем, если анализ нужно провести быстро и с небольшими затратами, вполне приемлемы 2% агарозные гели. Обычно при амплификации ДНК, выделенной из фиксированных тканей, выход ПЦР-продуктов ниже, и они менее специфичны, чем в случае амплификации высокоочищенной ДНК.

Метод гибридизации ПЦР-амплифицированной ДНК (по Саузер- ну) позволяет идентифицировать полосы в геле, наблюдаемые после электрофореза амплифицированной ДНК. Для гибридизации используются как изотопно, так и неизотопно меченые зонды.

Дот-блот-гибридизация дает простой ответ по типу «да-нет» и особенно полезна в тех случаях, когда проводится анализ большого числа образцов.

Прямое секвенирование амплифицированной ДНК — также высоконадежный метод доказательства ее специфичности, но применяется в основном для определения точечных мутаций генов. В последние годы для детекции и одновременно количественной оценки амплифицированной ДНК все больше начинают применять гибридизационно-ферментный метод на микропланшетах. Но существуют и другие варианты: используются олигонуклеотидный зонд, его метят дигоксигенином или флуоресцеином с последующим проявлением моноклональными антителами к дигоксигенину или флуоресцеину; меченные ферментами моноклональные антитела к двухцепочечной ДНК; зонд, меченный рутением (электрохемилюминесцентный метод). Весьма перспективна для количественных детекций амплификонов на гель-электрофореграммах миниатюрная видеокамера, передающая на экран монитора интенсивность флуоресценции полос ДНК-амплификонов, что позволяет одновременно получить соотношение полос ДНК-стандарта и ДНК-амплификонов исследуемого гена.

Результат ПЦР можно квалифицировать как положительный или отрицательный в зависимости от того, обнаружена в образце интересующая вас последовательность-мишень или нет. Однако нарушение нормального хода амплификации, недостаточная чувствительность метода и непредвиденный полиморфизм последовательности-мишени в области связывания праймеров или гибридизационного зонда порой обусловливают ложноотрицательный результат. При загрязнении образцов и случайной гомологии между зондом, праймерами и последовательностью, сходной с мишенью, получаются ложноположительные результаты.

Модификации.В последние годы широко используется такой простой прием, как «горячий старт ПЦР», который заключается в предварительном прогревании пробирок с ПЦР-амплификационной смесью при температуре 95 °С в течение 3-5 мин. Такой прием предупреждает амплификацию неспецифических ДНК-фрагментов

вследствие низкотемпературного, неспецифического спаривания праймеров.

При использовании РНК в качестве матриц для ПЦР предварительно на этой РНК-матрице посредством фермента РНК-зависимой ДНК-полимеразы (обратная транскриптаза, ревертаза) синтезируют комплементарную ДНК (кДНК), затем использующуюся в качестве матрицы в ПЦР. ПЦР с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР) широко применяется для детекции РНК вирусов, определения экспрессии вирусных, бактериальных и клеточных генов по их РНК.

Существуют различные модификации ПЦР, использующиеся в зависимости от конкретных целей проведения реакции или от характера последующего молекулярного анализа амплификатов. Так, для трудноамплифицируемых участков ДНК (содержащих различные повторяющиеся последовательности или необычные структурные элементы), а также в тех случаях, когда матричная ДНК присутствует в следовых количествах, ПЦР проводят в два этапа, используя в качестве матричной ДНК на втором этапе амплификации продукты ПЦР, синтезированные на первом этапе. Часто в этих случаях для повышения специфичности посадки праймеров применяют систему так называемых вмонтированных праймеров, т. е. при доамплификации в качестве праймеров выбирают последовательности, локализованные внутри амплифицированного на первом этапе участка ДНК.

В ряде случаев удобно проводить мультиплексную ПЦР, т.е. одновременную амплификацию нескольких участков матричной ДНК. Можно получать меченые продукты ПЦР, добавляя в реакционную смесь меченые dNTP. Особого внимания заслуживает возможность проведения ПЦР с молекулами кДНК. На основе этой реакции разработаны методы анализа экспрессии генов и получения больших количеств кДНК. Реакция амплификации осуществима не только в растворах, но и непосредственно на хромосомных препаратах, при этом в случае использования меченых нуклеотидов продукты амплификации гибридизуются и выявляют комплементарные им участки ДНК на хромосомах. До настоящего времени доступными амплификации были участки ДНК, не превышающие по длине 5 тыс. пар оснований. В последнее время благодаря внесению ряда кардинальных усовершенствований (особый подбор праймеров, использование сразу двух различных ДНК-полимераз, специального температурного режима полимеразных циклов) возможно про-

ведение амплификации фрагментов ДНК, достигающих 35 тыс. пар оснований.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Поделиться

ВАЖНО!

Информацию из данного раздела нельзя использовать для самодиагностики и самолечения. В случае боли или иного обострения заболевания диагностические исследования должен назначать только лечащий врач. Для постановки диагноза и правильного назначения лечения следует обращаться к Вашему лечащему врачу.

Кроме простого увеличения числа копий ДНК (этот процесс называется амплификацией), ПЦР позволяет производить множество других манипуляций с генетическим материалом (введение мутаций, сращивание фрагментов ДНК), и широко используется в биологической и медицинской практике, например, для диагностики заболеваний (наследственных, инфекционных), для установления отцовства, для клонирования генов, введения мутаций, выделения новых генов.

Специфичность и применение

ПЦР — метод молекулярной диагностики, ставший для ряда инфекций «золотым стандартом», проверен временем и тщательно апробирован клинически. Метод ПЦР позволяет определить наличие возбудителя заболевания, даже если в пробе присутствует всего несколько молекул ДНК возбудителя.

После соединения (гибридизации) матрицы с праймером (отжиг), последний служит затравкой для ДНК-полимеразы при синтезе комплементарной цепи матрицы.

Для проведения ПЦР в простейшем случае требуются следующие компоненты:

• ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать;
• два праймера, комплементарные концам требуемого фрагмента;
• термостабильная ДНК-полимераза;
• дезоксинуклеотидтрифосфаты (A, G, C, T);
• ионы Mg2+, необходимые для работы полимеразы;
• буферный раствор.

Обычно при проведении ПЦР выполняется 20 — 35 циклов, каждый из которых состоит из трех стадий. Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94 — 96°C (или до 98°C, если используется особенно термостабильная полимераза) на 0,5 — 2 минуты, чтобы цепи ДНК разошлись. Эта стадия называется денатурацией — разрушаются водородные связи между двумя цепями. Иногда перед первым циклом проводят предварительный прогрев реакционной смеси в течение 2 — 5 минут для полной денатурации матрицы и праймеров.

Когда цепи разошлись, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Эта стадия называется отжигом. Температура отжига зависит от праймеров и обычно выбирается на 4 — 5°С ниже их температуры плавления. Время стадии — 0,5 — 2 минут.

ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, используя праймер в качестве затравки. Это — стадия элонгации. Температура элонгации зависит от полимеразы. Часто используемые полимеразы наиболее активны при 72°C. Время элонгации зависит как от типа ДНК-полимеразы, так и от длины амплифицируемого фрагмента. Обычно время элонгации принимают равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований. После окончания всех циклов часто проводят дополнительную стадию финальной элонгации, чтобы достроить все одноцепочечные фрагменты. Эта стадия длится 10 — 15 мин.

Подготовка материала к исследованию и транспорт его в лабораторию

Для успешного проведения анализа важно правильно собрать материал у пациента и правильно провести его подготовку. Известно, что в лабораторной диагностике большинство ошибок (до 70%) совершается именно на этапе пробоподготовки. Для взятия крови в лаборатории ИНВИТРО в настоящее время применяются вакуумные системы, которые с одной стороны минимально травмируют пациента, а с другой — позволяют произвести взятие материала таким образом, что он не контактирует ни с персоналом, ни с окружающей средой. Это позволяет избежать контаминации (загрязнения) материала и обеспечивает объективность анализа ПЦР.

1. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер. с англ. — М.: Мир, 2002. — 589 с., илл. ISBN 5-03-003328-9
2. Щелкунов С.Н. Генетическая инженерия — Новосибирск: Сиб. унив. изд-во, 2004. — 496 с.; илл. ISBN 5-94087-098-8
3. Патрушев Л.И. Искусственные генетические системы — М.: Наука, 2005 — В 2 т. — ISBN 5-02-033278-X
4. http://ru.wikipedia.org/wiki

ВАЖНО!

Информацию из данного раздела нельзя использовать для самодиагностики и самолечения. В случае боли или иного обострения заболевания диагностические исследования должен назначать только лечащий врач. Для постановки диагноза и правильного назначения лечения следует обращаться к Вашему лечащему врачу.

Проведение ПЦР-анализа (PCR diagnostics) начинается с забора материала для исследования врачом-гинекологом, урологом или дерматовенерологом. Качество, достоверность полученных впоследствии результатов обеспечивается высочайшей квалификацией и огромным опытом работы врачей медицинского центра «Евромедпрестиж» , соблюдающих все необходимые правила проведения ПЦР-анализа: полная стерильность, использование исключительно одноразовых материалов.

Забранный материал со щеточки помещают в контейнер с физраствором. После забора пробы как можно скорее должны быть доставлены в ПЦР — лабораторию.

Проведение в лаборатории ПЦР-анализа происходит в три этапа:

1. Выделение ДНК
2. Амплификация ДНК-фрагментов
3. Детекция ДНК-продуктов амплификации

Выделение ДНК — это первоначальный этап проведения ПЦР-диагностики, суть которого заключается в следующем: врач забирает у пациента материал для исследования и подвергает его специальной обработке. В процессе обработки происходит расщепление двойной спирали ДНК на отдельные нити. В материал пациента добавляется специальная жидкость, растворяющая органические вещества, мешающие «чистоте» проведения реакции. Таким образом удаляются липиды, аминокислоты, пептиды, углеводы, белки и полисахариды. В результате образуется ДНК или РНК.

Принцип метода ПЦР заключается в «строительстве» новых ДНК или РНК инфекций. Без удаления клеточного материала осуществить это невозможно.

Количество времени, затраченного на выделение ДНК, зависит от возбудителя инфекции и от вида используемого для исследования методом ПЦР материала. Например, для подготовки крови к следующему этапу требуется 1,5–2 часа.

Амплификация ДНК

Для осуществления следующего этапа ДНК-диагностики — амплификации ДНК — врачи используют так называемые ДНК-матрицы — молекулы ДНК инфекций, на которые впоследствии будет происходить «клонирование» ДНК. Уже упоминалось, что наличие полной ДНК инфекции необязательно, для проведения этого этапа достаточно небольшого кусочка молекулы ДНК, который присущ только данному микробу (инфекции).

В основе амплификации ДНК и соответственно в основе всего принципа ПЦР-реакции лежит естественный для всего живого процесс достраивания ДНК — репликации ДНК, который осуществляется путем удвоения единичной цепочки ДНК.

Начав с одного-единственного фрагмента ДНК, врач-лаборант копирует его и увеличивает количество копий в режиме цепной реакции: после первого цикла у вас уже есть 2 фрагмента, после второго цикла — 4, после третьего — 8, после четвертого — 16, затем 32, 64, 128, 256. С каждым циклом происходит удвоение числа копий, и после двадцати циклов счет уже идет на миллионы, а после тридцати — на миллиарды. Цикл длится считанные минуты и сводится к определенному изменению температурного режима в очень небольшом химическом реакторе. Здесь в растворе в достаточном количестве находятся все нужные компоненты синтеза, прежде всего, нуклеотиды А, Г, Т и Ц, а также проведены тонкие подготовительные химические операции для того, чтобы с каждого готового отрезка ДНК тут же снималась точная копия, затем с этой копии — снова копия, в этом и состоит разветвленная цепная реакция.

Путем присоединения к цепи ДНК праймеров — искусственно синтезированных «кусочков» ДНК (нуклеотидных пар), аналогичных ДНК микробов (инфекции) — образуются две короткие, состоящие из двух цепей участков ДНК, спирали, необходимые для синтеза будущей ДНК.

Синтез новой цепи происходит путем достраивания каждой из двух нитей ДНК. Процесс амплификации происходит с помощью специфического участка — ДНК-полимеразы, давшему название лабораторному методу. Полимераза выступает в роли катализатора реакции и следит за последовательным прикреплением нуклеотидных оснований к растущей новой цепи ДНК.

Таким образом, амплификация ДНК представляет собой многократное увеличение числа копий ДНК, которые специфичны, т. е. присущи только определенному организму. Нет необходимости достраивать всю цепь ДНК, чтобы увидеть возбудителя инфекции. Нужен только тот участок, который характерен для данной бактерии как для индивидуальности.

Все многочисленно повторяющиеся этапы амплификации происходят при различных температурах. Для проведения ПЦР-анализа используется специально программируемое оборудование — ПЦР — термостат или амплификатор, которое автоматически осуществляет смену температур. Амплификация проводится по заданной программе, соответствующей виду определяемой инфекции. В зависимости от программы и вида определяемой инфекции процесс автоматизированной ПЦР занимает от 2 до 3 часов.

Важное значение в ПЦР-диагностике играет квалификация врача-лаборанта, проводящего анализ, от него зависит правильность настройки ПЦР-оборудования и интерпретация полученных результатов. Врачи медицинского центра «Евромедпрестиж» имеют большой опыт в проведении ДНК-диагностики, что обеспечивает достоверность полученных результатов исследования и гарантирует положительный успех в лечении инфекционных заболеваний. Чтобы сдать анализы методом ПЦР и провести полную диагностику и лечение инфекционных заболеваний в нашем медицинском центре «Евромедпрестиж».

В процессе детекции продуктов амплификации проходит разделение полученной смеси продуктов амплификации. К смеси добавляется специальные растворы, которые наделяют фрагменты ДНК способностью флуоресцировать — отражаться оранжево-красными светящимися полосами. Образующееся свечение выдает присутствие ДНК вирусов, микробов или бактерий в забранном у пациента на ПЦР-анализ материале.

СТАТЬИ

Меланома

Что такое меланома? Опасна ли она? И каким способом можно её диагностировать на раннем этапе?

ВОПРОС-ОТВЕТ

Вопросы по темам

ОТЗЫВЫ

Хочу выразить благодарность вашему доктору эндокринологу Резник Сергею Марковичу. У этого доктора я наблюдаюсь в течение многих месяцев. Постоянно контролирую уровень сахара в крови и гормоны щитовидной железы. Мне 47 лет, сахарным диабетом болею с 14 лет, на инсулине. Сергей Маркович так же отличный диетолог, что очень важно при моем диагнозе. Все его рекомендации идут только на благо и отличное самочувствие.

С уважением, Александр Васильевич.

Огромное спасибо за медицинскую помощь и подобранный курс лечения! Особую благодарность выражаю гастроэнтерологу Ровенских Татьяне Павловне!